Fluorestsentsmikroskoopia: põhimõtted meetod

Absorptsioon ja reemissiooni valguse täiendavalt anorgaanilistest ja orgaanilistest vedelikud on tingitud Fosforiloiste või fluorestsentsi. Erinevus nähtused on kestust vahele imendumine ja valguskiirgusest muutumises. Kui fluorestsentsi neid protsesse tekkida peaaegu üheaegselt, samas fosforetsents - mõningase viivitusega.

ajalooline teave

1852, Briti teadlane Stokes, esimene kirjeldatud fluorestsentsi. Ta tutvustas uut mõistet tulemusena eksperimendid fluoriidi, mis eraldavad punane tuli ultraviolettvalguses. Stokes märkida huvitav nähtus. On leitud, et lainepikkuse fluorestseeruva kiirgus on alati suurem kui voolu ergastusvalguse.

Kinnitamaks hüpoteesi 19. sajandil on olnud palju katseid. Nad näitasid, et erinevate proovide fluorestseeruda mõjul ultraviolettvalguses. Materjalide hulgas, muu hulgas olnud kristallid, vaikude, mineraalid, klorofülli, puhastamata narkootikumid, anorgaanilised ühendid, vitamiinid, õlid. Otsene kasutamine värvained bioloogiliste testide algas alles 1930. aastal

Fluorestsentsmikroskoopia: kirjeldus

Teiste kasutatavate materjalide esimesel poolel 20. sajandi uuringud näitasid kõrget spetsiifilisust. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Tänu tegevusele, mida ei ole võimalik saavutada, vastandades meetodeid, meetod fluorestsentsmikroskoopiat on muutunud oluliseks vahendiks biomeditsiini ja bioloogiliste uuringutega. Samavõrd oluline tulemused saadi, ja materjalidele.

? Missuguseid eeliseid meetod fluorestsentsmikroskoopiat? Kasutades uusi materjale on saanud võimalikuks ja valiku väga spetsiifilised rakkude submikroskoopiliste komponente. Fluorestsentsmikroskoopia suudab tuvastada ühe molekuli. Erinevaid värve võimaldab tuvastada mitu elementi korraga. Vaatamata piiratud ruumiline difraktsiooni piirini seadmed, mis omakorda sõltub konkreetsest proovi omadustest, identifitseerimine molekulid allpool seda taset on ka täiesti võimalik. Erinevad proovid pärast kiiritamist eksponeerida autofluorestsentsist. See nähtus on laialt kasutusel petrology, botaanika, pooljuhtide tööstuses.

Omadused

Uuring loomsetest kudedest või patogeenide sageli keeruline või liiga nõrk või väga tugev mittespetsiifilised autofluorestsentsist. Siiski väärtus uuringud omandab sissetoomine materjali komponendid ergastada konkreetse lainepikkusega ja kiirgavad vajalikud valguse voolu tugevusega. Fluorokroomid toimida värvained võimeline iseseisvalt kinnitatud konstruktsioonid (nähtavad või nähtamatud). Seega on neil kõrge selektiivsus märklaud ja kvantsaagisesse.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorestsentsmikroskoopia on laialt kasutusel, sest tulek looduslikke ja sünteetilisi värvaineid. Neil oli teatud intensiivsusega profiilid heitmete ja erutus ja suunatud konkreetsete bioloogilise eesmärke.

Määramine individuaalsete molekulide

Sageli ideaalsetes tingimustes, saate registreerida eraldi element kuma. Sel muu hulgas on vaja anda piisavalt madal müratase detektor ja optilise taustal. Fluorescein molekuli rikke tõttu fotopleegitamisele võib paisata kuni 300 tuhat krooni. Footonite. 20% kogumise protsessi tõhusus ja saab registreerida need koguses umbes 60 tuhat krooni.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorestsentsmikroskoopia põhineb Laviinfotodiood või elektroonilise korrutamine võimaldas teadlastel jälgida käitumist üksikute molekulide kaudu teise, ja mõnel juhul isegi minutit.

keerukus

Võtmeküsimus kasuks mahasurumiseks optiline müra taustal. Tulenevalt asjaolust, et paljud materjalid, mida kasutatakse projekteerimise filtrite ja läätsed on mõningane autofluorestsentsist, teadlaste pingutused varajases staadiumis olid suunatud komponentide tootmist, millel on madal fluorestsentsi. Kuid hilisemad katsed on viinud uute järeldusteni. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Eelkõige leiti, et fluorestsentsmikroskoopiat kogumassist sisepeegeldus, see võimaldab saavutada väikese tausta ja suure intensiivsusega ergastuskiirguse.

mehhanism

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Põhimõtteid fluorestsentsmikroskoopiat kogumassist sisepeegeldus on kasutada lõpmata laine või kaduvväike. Seda esineb vahelise piiri juures media erinevate murdumisnäitajatega. Sel juhul valguskiire läbib prisma. Ta on kõrge murdumisnäitaja parameetrit.

Prisma külgneb vesilahusena või klaasist madala parameetrit. Kui valguskiir suunatud seda nurga all, mis on enam kriitiline, valgusvihu täiesti peegeldunud pesaga. See nähtus, mis omakorda põhjustab nonpropagating lained. Teisisõnu genereeritud elektromagnetvälja mis tungib keskmise madalama murdumisnäitaja parameetri kauguseni alla 200 nanomeetrit.

Haihtuv laine valguse intensiivsus oleks piisavalt erutada fluorofoorid. Kuid tänu oma äärmiselt väike sügavus, selle maht on väga väike. Tulemuseks on madala tasemega taustal.

modifikatsioon

Fluorestsentsmikroskoopia põhineb kõigi sisemiste peegeldus, saab rakendada epi-valgustus. See nõuab läätsed kõrge apertuurarv (vähemalt 1,4, kuid on soovitav, et see saavutas 1,45-1,6) ja osaliselt valgustatud valdkonnas aparaati. Viimane on saavutatud väikese koha suurus. Suhe suurem ühetaolisus peene tsükkel, mis blokeeritakse voolu osa. Otsustavaks nurk, mille järel on kokku peegeldus, peame kõrgetasemeline murdumise keelekümbluse keskkonnas objektiivi ja katteklaasist mikroskoobi.