Molekulaargeneetika uurimismeetod

Avastada ja tuvastada variantide DNA struktuuri kasutatakse molekulaarigeneettiset meetodit. Iga DNA piirkond, mis uurib selles piirkonnas kromosoomis geeni või alleeli meetodid erinevad. Igaühe aluseks molekulaargeneetilised meetod hõlmab üht või teist manipuleerimine RNA ja DNA. Kõik need meetodid on iseloomulik tohutu keerukus, ilma laboritingimustes ei saa läbi, ja töötajad peavad olema kõrgelt kvalifitseeritud. See töö viiakse läbi mitmes etapis.

etappidel

Esiteks RNA või DNA proovide toota. Siin kasutati molekulaarigeneettiset meetodit saab kasutada praktiliselt iga materjali: veretilga leukotsüüdid, fibroblastid kultuuri, limaskesta (risoom), isegi karvanääpsud, - DNA võib saada igast proovist. See sobib kasutada mis tahes molekulaargeneetilised meetodid ja nende erinevad võimalused ning juba ammu eraldati DNA säilitatakse külmutatuna. Teine etapp on pühendatud kogunemine soovitud fragmentide (amplifikatsiooni) DNA, kuna see aitab tagada polümeraasi ahelreaktsiooni in vitro (in vitro osaluseta elusorganism). Selle tulemusena valitud DNA fragment korrutab seda ahelreaktsiooni ja DNA kogus suureneb sõnalt miljoneid kordi.

Kolmas samm molekulaargeneetilises uurimismeetodeid eeldatakse paljunenud DNA liik (see killustumine, pisaravool või lõikamiseks). Liik teostati elektroforees Polüakrüül või agaroosgeelil. See molekulaargeneetilised meetodit uurides DNA fragment võimaldab kõigil võtta mingis positsioonis geelist. Seejärel geeli töödeldakse etiidiumbromüdiga, mis on võimelised seostuma DNA, kiiritamist ultraviolettkiirguse, siis on võimalik jälgida luminestsents portsjonitena. Molekulaarigeneettiset diagnostikameetodite on väga mitmekesised ja arvukad, kuid kaks esimest etappi on ühised kõigile. Aga selleks, et selgitada DNA fragmente, saab geeli värvitud ja paljusid teisi olemasolevaid meetodeid.

liigid

Kõige otsesem ja laialtlevinud avastamise meetodeid mükobakterite võivad sisaldada ülaltoodud molekulaarigeneettiset DNA õppimismeetodina. Oma olemuselt on see, et välja selgitada skaneerimisahelat materjali spetsiifiliste DNA fragmentide patogeenide. Molekulaarigeneettiset diagnostikatehnoloogiad veel ei ole tõhusamat tunnustada selliste haiguste nagu tuberkuloos. Kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), võite olla kindel, et esialgne DNA suurendab koopiate arvu miljon korda, see tähendab, tekib võimendamine ja see kuvab tulemused. Tundlikkus tase on väga kõrge - rohkem kui üheksakümmend viis protsenti, mis on peamine eelis on see meetod.

Ülejäänud molekulaargeneetilised uurimismeetodeid tõhususe kohta saagis mitme koopiana sõnalt kahekordistunud, kuna sel juhul koostamise proovi näitab konkreetse oligonukleotiidjärjestusele tõusis 106 korda. Isegi kultuuri tuberkuloosi diagnoosimist hingamiselundite vähenda märgatavalt selle tundlikkus. See on põhjus, miks kaasaegne meditsiin põhineb molekulaargeneetika meetodeid tuberkuloosi diagnoosimiseks. A. Selles meetod on tõhus eriti kui tegemist on patogeenide kõrge antigeense varieeruvus kindlaks, et teised viis on palju keerulisem - nõuab erilist toitekeskkonnale ja kultiveerimismaterjali kaua. Biochemical ja molekulaargeneetilised meetodid tekitavad väga erinev mõju tulemusi.

tuberkuloosi diagnoosimiseks

Marshall PCR tuberkuloosi diagnoosimist enim kasutades neid DNA järjestusi, mis on spetsiifilised kõiki nelja tüüpi haigus. Selle eesmärgi saavutamiseks kasutavad sageli praimereid, mis tuvastavad järjestuse IS elemendid (IS-986, IS-6110), kui neid elemente iseloomustamiseks Siirdekalu Mycobacterium tuberculosis ja alati olemas mitu koopiat genoomi. Ka DNA eraldamise võib läbi viia alates puhaste kultuuridega and Clinical (röga patsientidest) mis tahes muu sobiva meetodi abil. Näiteks on olemas Boom meetodit, kus lüüsipuhvrid kasutatakse põhineb guanidiintiotsüanaadist ja ränidioksiidi kandjana DNA. Patsientide arv, mis erinevad halb bakterioloogiliste kasvab iga aastaga ja seega kliinilises praktikas on loonud täiesti erinev organiseerituse tase: molekulaargeneetilised meetod õppimise DNA on mänginud olulist rolli diagnoosi.

Kuid me peame tunnistama, et see ei ole ilma puudusi. PCR meetod on kasutada sageli toob tohutu hulk valepositiivseid tulemusi, ja põhjus ei ole mitte ainult tehnilisi vigu, kuid ka omadused meetod ise. Lisaks selle meetodi diagnoosi määramiseks elujõulisuse mükobakterite, mis on tuvastatud, see on lihtsalt võimatu. Aga see puuduseks ei ole kõige olulisem. Molekulaargeneetilised meetodid PCR diagnostika kaasneb Saastumisohu mükobakterite DNA. Sertifikaat nõuded sel põhjusel, et PCR laborites loodud eranditult raske, nad vajavad kolme eraldi ruumides. PCR tehnoloogia on kaasaegne ja väga keeruline, see nõuab asjakohase varustuse ja kõrge väljaõppega personal.

bakterioskoopia

Kui diagnostika analüüsi tulemused tuleb võrreldes teiste andmed: kliiniline läbivaatus, röntgeni-, mustamine mikroskoopia, põllukultuuride ja isegi vastuseks konkreetse ravi on väga oluline. Selles seerias PCR uuringud on ainult üks komponentidest. Tuvastada haigustekitaja varajase diagnoosimise võib olla lihtsaim ja kiireim meetodid - bakterioloogiliste.

Seal kasutatakse valgusmikroskoobi (värvimiseks Ziehl-Neelseni) ja fluorestseeruva (värvimine fluorokroomide). Eeliseks on kiirus mustamine tulemusi. Kuid selle puuduseks peetakse õigustatult piiratud võimsust tõttu madal tundlikkus. Kuid see meetod on antud WHO soovituse kõige ökonoomsem ja maapinna avastamiseks tuberkuloosihaigete. Mükobakterite bakterioloogilise on ennustus väärtus ja kvantitatiivselt hinnata bakterite eritumist. Palju rohkem kindel, et sellega tegeleda molekulaarigeneettiset uurimismeetodeid tuberkuloosi.

Kultuurid

Parem Mükobakterite tunda kultuurilugu. Külvi patoloogilise materjali on tehtud muna keskmise: Mordovsky, Finn II LJ jms. Võrdlusandmed resistentsuse mükobakterite ravimitele ja kaudsed tõendid tõhususe mitmeid mükobakterite ja nende kolooniad in vitro, kui rakendatakse uurimismeetodeid kultuuri. Osakaalu suurendamine isoleerimise mükobakterite nakatamist patoloogilise materjali talletatud mitmele keskkondades.

Vajaduste rahuldamine arvukalt kultuuri, patogeeni sealhulgas toetuste ja vedelikud. Selles süsteemis kasutatud ja automatiseeritud mõõtmine tüüp VANTES kasvu. Põllukultuurid peavad toimuma inkubatsiooni kuni seitse kuni kaheksa nädalat. Selleks ajaks põllukultuuri juurde kasvu puudumine võib pidada negatiivseks. Kõige efektiivsem viis avastada Mycobacterium tuberculosis kaaluda bioloogilistes proovides: diagnostilise materjali infect merisead, mis on väga vastuvõtlikud TB.

mõned arvud

Huvitavad erialal, mille avas PCR diagnostika oli uurida M. tuberculosis - varjatud nakkuse. Kaasaegne mõiste TB infektsioon soovitab välja sada inimest, kes olid kokku puutunud M. tuberculosis, üheksakümmend võib olla nakatunud, kuid ainult kümme neist on aktiivsed haiguse töötatakse. Teised on TB immuunsust, ja kuna üheksakümmend protsenti juhtudel infektsioon jääb varjatud. Avastamiseks muster see on aidanud molekulaarigeneettiset meetodit.

Geneetikud öelda, et viiskümmend viis protsenti inimestest, kelle põllukultuurid patoloogilise materjali olid negatiivsed, kaheksakümmend protsenti nakatunud inimeste M. tuberculosis, kuid voolab ilma röntgenileiu ilminguid, PCR positiivseid vastuseid saanud. See on geneetiline diagnostiline meetod aidanud selgitada riskirühma patsientidel PCR uuringud, mille tulemused nende analüüside (mikroskoopia ja kultuur) olid negatiivsed ja subkliinilise infektsiooni M. tuberculosis viibis.

kaasaegne teadus

Vene Föderatsiooni ja bakteriaalse laborid kasutavad kiirendatud meetodil absoluutses kontsentratsioonides: nitraat reduktaasi aktiivsus mükobakterite poolt testitud Griess reaktiiv. Anti-TB keskused kasutada meetodit, mis võimaldab kindlaks määrata ravimiresistentsuse. See külvamist vedelas keskkonnas, kus automatiseeritud radiomeetrilisi ja fluorestseeruva raamatupidamissüsteemi mükobakterite kasvu. Selline analüüs on tehtud kiiresti - kuni kaks nädalat.

Praegu töötatakse välja uusi meetodeid välja töötatud: ravimiresistentsuse mükobakterite mõõdetakse genotüübi tasandil. Uuring molekulaarsete mehhanismide geene ja näitab esinemisega mükobakterite. Need geenid on seotud resistentsuse teatud ravimid. Näiteks kasa geenid, Inha, katG resistentne isoniasiidi, rpoB geeni - rifampitsiin 16Sp RNA geenid ja rspL - streptomütsiini emb1 - kuni etambutool, gyrA - Fluorokinoloonrühma ja nii edasi.

mutatsioone

Kaasaegsetes diagnoosi oluliselt suurendanud molekulaargeneetilised tasemel meetodi uurimiseks DNA ja lasti läbi viia suuremahulisi uuringuid mutatsioonide kõikides oma spektrit. Nüüd me teame, et kõige levinum mutatsioonid 516, 526 ja 531 koodonit rpoB geeni, ning määrati kindlaks vastupidavust erinevatele narkootikume. On terve hulk meetodeid kirjutades mükobakterite kasutades mitte ainult traditsiooniliste meetoditega - biokeemiline, bioloogilise ja kultuurilise, vaid ka laialt kasutusel kaasaegne molekulaargeneetika meetodeid. Juba on olemas piisavad ja anda õige diagnoos meetod avastamiseks monogeensete haigusi. Need põhinevad DNA uuringud täpset pindala antud geeni. See on tavaliselt keeruline protsess, aeganõudev ja kulukas, kuid andmed, mis on sätestatud molekulaarigeneettiset analüüsi, on palju täpsem ja informatiivsem kui andmed kõikide teiste analüüside.

See on juba ammu teada, et DNA ei muutu kogu organismi elu, et see on igal tuumaga rakkude odnakova, ja see võimaldab võtta analüüsi absoluutselt kõik keharakud, igal etapil ontogeny. Kahjustatud geen võib tuvastada ilmumiseni esimese sümptomite täismõõtmetes kliinilist haigust, samuti tervetel heterosügootsete inimesed, kuid millel on mutatsioon geenis. Molekulaarigeneettiset pärilik haigus diagnostilised meetodid võimaldavad paljastada oma (otsene lähenemine, DNA-diagnostika), samuti analüüsida segregatsiooni haiguse pere marker lookused DNA (geneetilise polümorfismi), mis on tihedalt seotud kahjustatud geeni (st kaudse lähenemisviisi DNA-diagnostika). Otseselt või kaudselt - mis tahes DNA diagnostika põhineb tuvastamise meetodid rangelt määratletud osa inimese DNA.

otseste meetoditega

Otsesed meetodid DNA diagnostikaga kui süüdlane geeni pärilik haigus on tuntud, samuti tuntud ja tüübid selle mutatsioone. Näiteks sobiva otseste meetoditega mitmes haigused. See Huntingtoni korea (laiendamise CTG-kordust), fenüülketonuuria (R408W), tsüstiline fibroos (delF508, suured mutatsioonid) jms. Peamine eelis otsene meetod on täielikult kuuluv diagnostilist täpsust ning puudub vajadus teha DNA analüüsi ülejäänud pere. Kui mutatsioon vastava geeni leitakse, see võimaldab täpselt kinnitada diagnoosi pärilikkus, genotüübi määramiseks ülejäänud koormatud pere.

Teine eelis otsese diagnoosimise peetakse selgitada heterosügootse kandja halbu mutatsioone sugulased ja vanemad, kes suri haiguse. See kehtib eriti haiguste autosoomne retsessiivne. Puudused otseste meetoditega ka on olemas. Neid rakendada, mida pead teadma täpselt lokaliseerida ebanormaalne geen, ekson-intron struktuur selle spektri ja selle mutatsioone. Mitte kõik monogeensete haiguste täna saanud sellist teavet. Informatiivuse otseste meetoditega ei saa pidada täielikuks, sest üks ja sama geen võib olla suur hulk patoloogiliste mutatsiooni, mis põhjustab pärilike haiguste puhul.

kaudsete meetoditega

Kaudsed meetodid DNA diagnostika kasutatakse üldse muudel juhtudel, kui kahjustatud geen ei tuvastatud, kuid ainult kromosoomide või kui liin diagnoosi ei andnud tulemust (see juhtub, kui geeni keeruline molekulaarse organisatsiooni või suurel määral, kui on palju patoloogilised mutatsioonid). Kaudsed meetodid teostati segregatsiooni analüüsi polümorfsusmarkereid in alleelne perekonda. Markerid leitud sama kromosoomipiirkonnas või lookus on tihedalt seotud haiguse ja tähistavad deletsiooni või insertsiooni punkt asendusi, kordust, ja nende polümorfismi on tingitud erinevatest rakkude hulk plokki.

Kõige mugavam kaudse diagnoosi kaaluda mikrosatelliit- ja minisatelliit polümorfismi, mis on laialt levinud inimese genoomi. nende väärtus väljendatuna kõrge informatiivset sisu, kui kahjustus geneetilise vahemaa markeri ja geen ei ole liiga suur. Viimasel juhul, hinnanguliste täpsust määratakse suurel määral sagedusest rekombinatsiooni polümorfsusmarkeri ja kahjustuste suhtes. Kaudsed diagnostikameetodite ka kohustuslikud eeltegevust alleeli sagedused analüüsiti elanikkonna seas uuringu patsientidel ja kandjaid mutatsioonide pluss vajalikkust määramise tõenäosus rekombineerumisel nonequilibrium ka kinnitumist markerid ja mutant alleele.

muid meetodeid

Lühiajaline segmentides RNA või DNA, samuti ühe geeni visualiseerides mikroskoopilise uuringu saa olla seega mutatsioonide identifitseerimiseks vajalike molekulaarigeneettiset diagnoosi. On "Human Genome Project", samuti teiste edusammud molekulaargeneetikast oluliselt laiendatud võimalust diagnoosimiseks pärilike haiguste - nii pre- ja postnataalse. Need meetodid võivad anda varajane avastamine ja teha ennustus polü- ja monogeensete haigused, mille debüüt leiab aset täiskasvanueas. Kahjuks tõttu tehnilisi võimalusi molekulaarigeneettiset uuringud on mõnikord kaugemale eetilisi piire, mis on seatud seoses pärandist, eriti kui diagnoos on noorukieas ja lapsepõlve.

Struktuuri- ja numbrilisi kromosoomanomaaliad on kõige levinumad põhjused ja vähk, ja paljud väärarenguid. Kromosoomaberratsioone vaja kindlaks teha, mis on oluline pere nõustamine - hinnata prognoosi koos reproduktiivtervise riski tulevikus rasedust. Kromosoomanalüüsiga on "kuldstandardit" geneetilise diagnoosi, kuid see on piiratud. Ainult meetodites molekulaarigeneettiset analüüsi võib teha rohkem, sest seal kasutatakse kloonimist tehnoloogial põhinevate fluorestsentsmärgised võimeline oma suure tundlikkusega selgitada peent kromosoomimuutused mida ei õnnestunud tuvastada klassikalise tsütogeneetiline uuringud. Need meetodid on üha laienev meie diagnostika, kui uuritakse, laste arenguhäired, vaimne alaareng, paljude teiste pärilike haiguste.

järeldused

On väga oluline, et inimkonna olid geeni struktuuri ja funktsiooni teadmiste, tehnika varieeruvuse võimet tuvastada pärilike haiguste, mis ilmnesid seoses arengut molekulaargeneetika. meetoditest on suunatud uuringu DNA molekuli - ja kui see on normaalne, ja kui see on katki. Valmistamine desoksüribonukleiinhappe nukleotiidijärjestused (DNA) ulatub etappidena saamast proovid selgitada üksikute fragmente. Isoleerimine genoomse DNA rakkudest, liik (rebimine), amplifikatsiooni (kloonimine), elektroforees fragmentide (eraldades nende elektrilaengu ja molekulmassiga agaroosgeel-). Konkreetsete fragmendid paiknev pinnal diskreetne triip.

Siis sattumist teo filtrid, mida läbib iga fragmendi hübridiseerumisel kloonitud DNA fragmendid või sünteetilise radioaktiivsete sondide on kontrolli, mis kestab võrduma iga uuritava proovi. Kui muudate positsiooni või pikkus võrreldes sondi, kui uus fragment või kadunud - kõik see näitab, et analüüsitud geeni on läbinud ümberkorraldamise nukleotiidjärjestus. Seal on kaheksa põhilisi tehnikaid molekulaar geneetilised uuringud: sekveneerimine (määramist DNA järjestus), polümeraasi ahelreaktsiooni (kasv jadade arv), mille valmistamist praimereid tuntud geenide DNA kloonimine, rekombinantse molekuli päritoluga valke tingitud rekombinantsed molekulid, tekitades komplekt (kogumine raamatukogu) kloonitud fragmente, mis saadi, kasutades liik.